Hornung, Jan

Zur Kryokonservierung adhärierter Zellen

Reihe: Akademische Abhandlung zur Biologie
ISBN: 978-3-89700-044-6
1998
Preis: 34,90 €
135 Seiten

Abstract

In der vorliegenden Arbeit werden methodische Aspekte einer Kryokonservierung von adhärierten Zellen auf artifiziellen Substraten vorgestellt. Die Motivation für diese Untersuchungen folgt aus der Suche nach geeigneten Verfahren zur langfristigen Aufbewahrung von Zellen auf funktionalen und geeignet strukturierten Oberflächen, die zunehmend zur Kultivierung, Charakterisierung und Manipulation der Zellen in der biologischen und medizinischen Forschung Verwendung finden. Beispiele sind Zellsensoren und auf Oberflächen in geordneter Weise angelegte neuronale Netzwerke. Als Untersuchungsobjekte wurden Fibroblasten der Maus in Form von etablierten Zellinien (NIH-3T3, L929) gewählt, die sich auf strukturierten Glas- bzw.\ Silizium- materialien kultivieren lassen.
Besondere Aufmerksamkeit wurde der Untersuchung der Zelladhäsion und deren Beeinflussung durch den Gefrier- und Auftauprozeß gewidmet. Ausgehend von der aus geometrischen Modellbetrachtungen abgeleiteten Vermutung einer hohen Widerstandsfähigkeit von stark ausgebreiteten und ausreichend adhärierten Zellen gegenüber osmotischen Veränderungen und mechanischen Belastungen wurden die Zellen in unterschiedlichen Stadien der Zelladhäsion einem Gefrier- und Auftauzyklus unterworfen und nachfolgend die Zellvitalität eingeschätzt. Parallel dazu erfolgte vor und nach der Konservierung eine Bewertung der Adhäsionstopographie der Zellen mittels Totalreflektionsmikroskopie (TIRM). Hierbei zeigte sich, daß Veränderungen in der Zelladhäsion auftreten können, die sich unter anderem in einer Ausbildung von Membraneinstülpungen an der ventralen Membran äußern.
Um die Zelladhäsion zu unterstützen, wurden die Substrate mit einer Polylysinbeschichtung versehen. Diese unspezifische Adhäsionsverstärkung führte innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Aussaat zu einer charakteristischen Topographie und einer erhöhten Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischen Belastungen, nicht jedoch zu einer grundsätzlich höheren Überlebenswahrscheinlichkeit der konservierten Zellen. Die Polylysin-induzierte Adhäsionstopographie ist durch eine netzartige Kontaktstruktur mit sehr engen Zell-Substrat Verbindungen gekennzeichnet.
Weitere Untersuchungen dienten der Einschätzung von osmotischen Belastungen, die unter anderem bei der Zugabe von Gefrierschutzmitteln (Additiven) auftreten können. Dazu wurden die Zellen in Suspensionen unterschiedlicher Osmolarität über\-führt und die Zellvolumina bei 0, 25 und 37\C ermittelt. Verhalten gemäß eines idealen Osmometers konnte annähernd nur bei 0 und 25\C, nicht jedoch bei 37\C beobachtet werden. Insbesondere bei 37\C ist eine überproportionale Volumenzunahme im hypotonischen Bereich charakteristisch. Mögliche Ursachen für dieses Verhalten werden im einzelnen diskutiert.
Der Vergleich der mittels Totalreflektionsmikroskopie gewonnenen Adhäsions- topographie mit der über Immunofluorochromierung darstellbaren Verteilung der Fokalkontakte ermöglicht eine qualitative Bewertung der verwendeten Methode. Aus weiteren Untersuchungen können Aussagen zur Beeinflussung der mikroskopischen Abbildungsqualität und deren Verbesserung abgeleitet werden.

Name      
Adresse   
          
          
Stadt     
Land      
Telefon   
Email     
Bemerkung